NEB Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit

New England Biolabs oferuje szeroki wybór rozwiązań do klonowań i mutagenezy, w tym zestaw do ukierunkowanej mutagenezy – Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit.
Zestaw jest wydajnym narzędziem, które pozwala na wprowadzanie mutacji punktowych, insercji lub delecji w czasie krótszym niż 2 godziny.
Zestaw jest dostępny z komórkami kompetentnymi lub bez.

  • Zastosowanie polimerazy wysokiej wierności gwarantuje wydajną i niezawodną amplifikację.
    Q5® High-Fidelity DNA Polymerase jest 280 razy bardziej wierna, niż polimeraza Taq, co znacząco redukuje częstość błędów popełnianych podczas amplifikacji.

  • Zastosowanie polimerazy typu HotStart umożliwia ustawienie reakcji w temperaturze pokojowej i zapobiega pojawieniu się niespecyficznych produktów amplifikacji.

  • Mieszanina enzymów KLD (Kinaza-Ligaza-DpnI) została zoptymalizowana dla maksymalnej wydajności reakcji.

  • Zestaw (#E0554) jest dostępny wraz z wysoce wydajnymi komórkami kompetentnymi NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)

  • Zestaw (#E0552) kompatybilny ze wszystkimi kompetentnymi szczepami E. coli.

  • Narzędzie NEBaseChanger™ pomaga w wygenerowaniu sekwencji starterów i ustawieniu reakcji PCR.

 

Ukierunkowaną mutagenezę przeprowadza się w oparciu o reakcję PCR, w której użyta jest polimeraza wysokiej wierności – Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase i odpowiednio zmodyfikowane oligonukleotydy (startery). Po reakcji PCR, zamplifikowany materiał jest bezpośrednio dodawany do unikalnej mieszanki enzymów Kinaza-Ligaza-DpnI (KLD) w celu szybkiej (5 minut) cyrkulizacji i usunięcia matrycy. Cała reakcja trwa niecałe dwie godziny. Uzyskanym kolistym plazmidem można transformować dowolne kompetentne komórki E. coli.

Narzędzie NEBaseChanger™ zostało opracowane, aby pomóc w wygenerowaniu sekwencji starterów i ustawieniu reakcji PCR

Substitutions, deletions and insertions are incorporated into plasmid DNA through the use of specifically designed forward (black) and reverse (red) primers. Unlike kits that rely on linear amplification, primers designed for the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit should not overlap to ensure that the benefits of exponential amplification are realized. A) Substitutions are created by incorporating the desired nucleotide change(s) (denoted by *) in the center of the forward primer, including at least 10 complementary nucleotides on the 3´side of the mutation(s). The reverse primer is designed so that the 5´ ends of the two primers anneal back-to- back. B) Deletions are engineered by designing standard, non-mutagenic forward and reverse primers that flank the region to be deleted. C) Insertions less than or equal to 6 nucleotides are incorporated into the 5´ end of the forward primer while the reverse primer anneals back-to-back with the 5´ end of the complementary region of the forward primer. D) Larger insertions can be created by incorporating half of the desired insertion into the 5´ ends of both primers. The maximum size of the insertion is largely dictated by oligonucleotide synthesis limitations.
Results from a substitution reaction (4 nt) using the back-to-back Control SDM Primer Mix and Control SDM Plasmid (6.7 kb) are shown, along with results from a 12 nt deletion experiment (5.8 kb plasmid) and an 18 nt insertion experiment (7.0 kb plasmid). In all three cases, over 90% of the resultant colonies had incorporated the desired mutation(s). Results are normalized to total transformants if cells were not diluted prior to plating. For comparison, the same substitution reaction (4 nt) was performed with the QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) following Agilent’s protocol and using Agilent’s primer design tool to design overlapping primers.

*Note that the QuikChange kit does not accommodate deletions and insertions of this size, so no comparison could be made for these experiments.